apteka szczecin mickiewicza

Obecność fosfoseryny w pozycji 345 (QARPGPQ [pS] PGSPLEEER) została ujawniona przez MS / MS, na podstawie różnicy masy wynoszącej 69 Da (dehydroalanina) pomiędzy jonami fragmentu y9 i y10 (Figura 1B). Dehydroalanina jest generowana po eliminacji kwasu fosforowego z fosfoseryny i jest powszechnie obserwowana w MS / MS (46, 47). Widmo MS / MS wykazało również, że Ser348 nie był fosforylowany, ponieważ dehydroalaniny nie wykryto w tej pozycji. Figura Analiza spektrometrii masowej fosforylacji p47phox indukowanej GM-CSFa: Ser345 był ufosforylowany w zagruntowanych ludzkich neutrofilach. (A) Analiza LC-MS / MS próbki mieszaniny peptydów tryptycznych p47phox (gradient: 0 ~ 38% acetonitryl w 35 minut). 2 górne panele przedstawiają chromatogramy pików podstawowych eksperymentów MS / MS jonizacji przez elektrorozpylanie, wykonanych podczas analizy w trybie pozyskiwania zależnym od danych. Dolny panel reprezentuje tylko podstawowy wykres chromatogramu MS. Strzałka wskazuje czas wymywania fosfopeptydu sekwencjonowanego przez MS / MS. (B) Identyfikacja fosforylowanego peptydu QARPGPQ [pS] PGSPLEEER (aminokwasy 338. 354). Widmo MS / MS pokazało prawie kompletną serię y-jonów, która odzwierciedla sekwencję aminokwasową i pozycję grupy fosforanowej w Ser345. Eliminacja kwasu fosforowego z reszty fosfoseryny podczas MS / MS wytworzyła resztę dehydroalaniny w pozycji odpowiadającej Ser345 (s, masa pozostałości, 69 Da). Widmo wykazało również, że reszta Ser348 (S) nie była fosforylowana (masa pozostałości, 87 Da). Zastosowanie przeciwciała przeciw fosfo-Ser345 pokazuje, że GM-CSF i TNF-a indukują fosforylację Ser345. Aby zbadać stan fosforylacji Ser345 w ekstraktach komórkowych, przygotowaliśmy poliklonalne przeciwciało skierowane przeciw fosfo-Ser345, stosując jako antygen peptyd QARPGPQ [pS] PGSPLEEER (aminokwasy p47phox 338. 354). Analiza Western błot lizatów całokomórkowych z GM-CSF. lub neutrofile traktowane TNF-a (z zaledwie 4 x 105 komórek) wykazały (Figura 2, A i B, p-Ser345), że to przeciwciało było wysoce specyficzne dla fosforylowanego p47phox, ponieważ nie rozpoznało innych ufosforylowanych białek. Całkowite białko p47phox wykryto przeciwciałem, które rozpoznaje niefosforylowane, jak również fosforylowane białko (Figura 2, A i B, p47phox). Fosforylowany i całkowity p47phox z kilku eksperymentów oznaczono ilościowo za pomocą densytometrii i ilości fosforylowanego p47phox skorygowanego o ilość p47phox. Razem, wyniki pokazują, że GM-CSF. a wywołana TNF-. fosforylacja p47phox w Ser345 była zależna od stężenia i czasu i ściśle odpowiadała efektom primingu GM-CSF i TNF-a. na O2 produkcja (29, 30) (rys. 2, A i B). Figura 2 Zastosowanie przeciwciała wobec fosfo-Ser345 pokazuje, że GM-CSF i TNF-a indukuje fosforylację p47phox na Ser345 w sposób zależny od stężenia i czasu. (A) Neutrofile (1 x 107 komórek / ml) inkubowano z różnymi stężeniami GM-CSF przez 20 minut lub inkubowano z GM-CSF (12,5 ng / ml) przez wskazany czas. Komórki poddawano lizie, a białka z 4 x 105 komórek analizowano za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingiem z przeciwciałem anty-fosfo-Ser345 (p-Ser345) lub przeciwciałem anty-p47phox (p47phox). (B) Neutrofile (1 x 107 komórek / ml) inkubowano z różnymi stężeniami TNF-a przez 20 minut lub inkubowano z TNF-a (10 ng / ml) przez wskazany czas. Komórki poddano lizie i białka z 4 x 105 komórek analizowano za pomocą SDS-PAGE i immunoblotting z przeciwciałem anty-fosfo-Ser345 lub przeciwciałem anty-p47phox
[hasła pokrewne: wodniak powrózka nasiennego, acetylowany adypinian diskrobiowy, złamanie collesa ]