curie skłodowskiej wrocław szpital

Komórki T zależne od IL-2 (5 x 106 na chorobę) aktywowano za pomocą IL-2, jak opisano powyżej. Komórki poddano lizie i przeprowadzono oznaczenie kinazy 3 kinazy fosfatydyloinozytolu (PI3), jak opisano (20). W przypadku eksperymentów, w których peptyd został dodany bezpośrednio do testu kinazy, komórki wytworzono bez traktowania peptydem przed immunoprecypitacją. Do reakcji na kinazę dodano jednocześnie peptyd (40 | jM), rapamycynę (100 nM) lub wortmaninę (100 nM) w tym samym czasie, co substrat lipidowy. Barwienie komórek i mikroskopia konfokalna. Długotrwała cytotoksyczna linia limfocytów T CD8 + (106 komórek / ml) była inkubowana w RPMI 1640 uzupełnionym DMSO lub DQ 65-79 (IRS (NIAVLKHNLNIVIKRRYIR) (40 .M) przez godzinę w 37 ° C. Po przemyciu 20 .l hodowli komórkowej (106 komórek / ml) umieszczono w studzienkach ze szkiełkowych płytek wstępnie powlekanych poli-L-lizyną i inkubowano przez 15 minut. Komórki następnie przemyto i utrwalono 4% paraformaldehydem w PBS (pH 7,4). Komórki permeabilizowano i zablokowano 20 ul 5% ludzkiej surowicy AB, 5% surowicy koziej, 0,1% NP-40, 0,01% saponiny (Calbiochem-Novabiochem Corp.) i 1% mleka w PBS. Następnie przemyto je i inkubowano z mAb anty-IRS (IgGl, Covance Research Products Inc., Richmond, California, USA) i mAb mAb anty-HLA klasy I (W6 / 32, IgG2a) przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po przemyciu komórek dodano 20. L drugorzędowych przeciwciał (skoniugowane z biotyną anty-mysie IgG1 i skoniugowane z FITC przeciwciało przeciwko mysiej IgG2a z PharMingen), a następnie koniugat Alexa Fluor 594 ze streptawidyna i koniugat anty-fluoresceina Alexa Fluor 488 (Molecular. Probes Inc., Eugene, Oregon, USA). Slajdy analizowano za pomocą laserowego mikroskopu konfokalnego MultiProbe 2010 firmy Molecular Dynamics (Sunnyvale, Kalifornia, USA). Wyniki DQ 65-79 nie hamuje ekspresji ani fosforylacji IL-2R. Wcześniej wykazaliśmy, że peptyd DQ 65-79 hamuje proliferację komórkową zależną od IL-2 (15). IL-2R o wysokim powinowactwie składa się z.,. I. łańcuchy, które w różnym stopniu podlegają stymulacji (21). Leczenie aktywowanych leukocytów krwi obwodowej peptydem lub rapamycyną nie miało wpływu na ekspresję któregokolwiek z tych łańcuchów, jak określono za pomocą cytometrii przepływowej, w porównaniu z kontrolą kontrolną DMSO lub peptydem kontrolnym DQ 65-79 (72D) (nie pokazano). . Ponadto, fosforylacja tyrozyny (22, 23). i . łańcuchy nie uległy wpływowi DQ 65-79, DQ 65-79 (72D) lub rapamycyny (dane nie pokazane). Tak więc działanie antyproliferacyjne peptydu występuje po fosforylacji IL-2R. DQ 65-79 nie ma wpływu na ogólną fosforylację tyrozyny lub na niereceptorową aktywność kinazy tyrozynowej. Chociaż nie wykryto wpływu DQ 65-79 na fosforylację IL-2R, możliwe było, że peptyd wpływał na inne bliższe zdarzenia. Fosforylacja białek w tyrozynie jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń po aktywacji (24). Białka fosfotyrozyny poddano immunoprecypitacji ze stymulowanych IL-2B komórek T i sondowano przeciwciałem anty-fosfotyrozynowym. Nie zaobserwowano zmiany w strukturze białek fosfotyrozyny w przypadku DQ 65-79 na komórkach stymulowanych IL-2 (3 w porównaniu z kontrolami (Figura 2a). Figura 2DQ 65-79 nie hamuje aktywności fosfotyrozyny po stymulacji IL-2. (a) Western blot z zastosowaniem mAb antyfosfotyrozynowego. (b) Western blot przy użyciu anty-Fyn lub anty-Lck. (c) Aktywność kinazy immunoprecypitowanych Fyn i Lck. NS, bez stymulacji; D, DMSO; Q, DQ 65-79; 72, DQ 65-79 (72D); R, rapamycyna. Kinazy Jak, Jak1 i Jak3, są kluczowymi mediatorami transdukcji sygnału IL-2R. W szczególności, Jak3, który ma ograniczoną ekspresję głównie do aktywowanych leukocytów, ma kluczowe znaczenie dla sygnalizacji, jak wykazał Jak3. /. mysz (25, 26)
[przypisy: badanie żywej kropli krwi wrocław, ból pod lewą łopatką przyczyny, badanie trus ]