Prądy jednokanałowe filtrowano przy 2 kHz, próbkowano co 50 mikrosekund i idealizowano stosując kryterium połowy wysokości z 3-punktową detekcją. Hodowlę lidokainy (1,5% bez konserwantów; Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA) dodano do pipety do łatek (pojedyncze kanały) lub roztworu do kąpieli (prądy całej komórki) w odpowiednich ilościach, aby uzyskać stężenia wskazane na każdej figurze. legenda. We wszystkich przypadkach dane rejestrowano po 5-minutowym okresie równoważenia. Połączone dane są wyrażone jako średnie. SD i porównano statystyczne stosując 1-sposób ANOVA. Funkcje wykładnicze lub Boltzmanna zostały dopasowane do danych przy użyciu nieliniowych metod najmniejszych kwadratów (Microcal Origin, Microcal Inc., Northhampton, Massachusetts, USA). Wrażliwości modeli bramkowania Markowa na blok lidokainy (patrz ryc. 7) zbadano za pomocą numerycznych metod integracji dostosowanych do sztywnych równań różniczkowych (29, 30) i połączono z oprogramowaniem napisanym specjalnie, jak opisano wcześniej (31). Rysunek 7 Trzy modele stanów Markowa z zależnym od stanu wiązaniem lidokainy. Symbole C, O i I reprezentują odpowiednio sumaryczny zamknięty, otwarty i nieaktywny stan kanału. (a) Oceniano schematy jedno-powinowactwa (model I) i powinowactwa 2 (model II) wiązania lidokainy. W kanale typu dzikiego stałe szybkości stosowane do przejść bramkowania po depolaryzacji były następujące (s. 1): kCO (to jest, zamknięte. Otwarte) = 665, kOC = 492, kOI = 1998, kIO = 2,9, kCI = 66. Wielkość kIC została określona na podstawie mikroskopowych ograniczeń odwracalności: kIC = kOCkCIkIO / (kOCkOI). W przypadku R1623Q różnice w typie dzikim wynosiły kOI = 658, a kCI = 492. W przypadku LQT3 jedyną różnicą w stosunku do typu dzikiego było kIO = 55. W modelach I i II stałe szybkości wiązania leku zawsze wynosiły × 108 s. 1M. 1. W modelu II stała dysocjacji wiązania lidokainy ze stanem C (kCoff) wynosiła 128,027 s Al (Kd 1,3 mM). W modelach I i II stała dysocjacji wiązania lidokainy ze stanem I (kIoff) wynosiła 383 s <1 (Kd 4. M). W obu modelach zakładaliśmy, że wiązanie lidokainy nie spowolniło stałej szybkości odzyskiwania z inaktywacji, jak to niedawno pokazano (38). Stąd kIL. CL był równy kIC. Stała szybkości w przód dla inaktywacji w stanie zamkniętym, gdy lidokaina jest związana (kCLaIl) została całkowicie określona (przez mikroskopową odwracalność) przez współczynniki wyłączeń dla wiązania leku z zamkniętymi i inaktywowanymi stanami i bez leku, stopień dezaktywacji w stanie zamkniętym jak następuje: kCL = IL = kCIkCoff / kIoff. Ponieważ KIoff kCl). (b) Symulowane prądy sodu z modeli I i II (patrz tekst). Wyniki Wpływ lidokainy na prądy R1623Q w całym oocytach. Aby zbadać ogólne cechy bramkowania R1623Q i bloku lidokainy, zbadaliśmy całą komórkę jajową INa (ryc. 1). Typu dzikiego (Figura 1a, część i) i R1623Q (Figura 1a, część ii) INa pokazano przed i podczas ekspozycji na 200. M lidokainy. Jak pokazano wcześniej, główną cechą fenotypu wolnego od leku R1623Q jest spowolniony zanik INa (22, 23), cecha która różni się od mutacji LQT3 w lub w pobliżu łącznika III-IV (10, 11, 15). Figura 1a pokazuje, że lidokaina ma niewielki wpływ na szybkość rozpadu INa typu dzikiego, ale przyspiesza zanikanie R1623Q INa, częściowo korygując nieprawidłowy fenotyp (22). Stopień zaniku INa określano ilościowo z wykorzystaniem wskaźnika niezależnego od modelu: czas od prądu szczytowego do zaniku 50% (. 50). Dane podsumowujące pokazują, że lidokaina nie tylko przyspiesza rozpad R1623Q INa (Figura 1b, AP <0,01), ale także blokuje szczyt R1623Q INa silniej niż typ dziki (Figura 1c, AP <0,05). Aby zidentyfikować mechanizm jednoczący dla tych odrębnych efektów lidokainy, zbadaliśmy bramkowanie kanału Na bardziej precyzyjnie, stosując nagrania z całych komórek i dołączonych do komórek w hodowanych komórkach ssaczych. Ryc. 1R1623Q kanały wykazują zwiększoną wrażliwość na lidokainę [więcej w: badanie żywej kropli krwi wrocław, wodniak powrózka nasiennego, aktualne występowanie grzybów ]