goczałkowice uzdrowiskowa 54

Ścieżki, które mogą być pośrednie, są pokazane ze strzałkami przerywanymi. PI-3K, PI3-kinaza; Rb, białko retinoblastoma; PKC, kinaza białkowa C; FKBP, białko wiążące FK-506. Metody Peptydy, przeciwciała i odczynniki. Peptydy przygotowano jak opisano (15). Rapamycin był prezentem od Wyeth-Ayerst Laboratories (Filadelfia, Pensylwania, USA). Wortmanninę zakupiono od Calbiochem-Novabiochem Corp. (San Diego, Kalifornia, USA). Specyficzne dla Ap kinaza p70 S6, Fyn i Lck zakupiono z Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, Kalifornia, USA). Ab do fosfotyrozyny (4G10), Jakl, Jak3, Fyn, Lck, Akt, p85 i p110-. zakupiono od Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, New York, USA). Ab specyficzne dla IL-2Ra, IL-2Ra i IL-2Ra. zostały zakupione od PharMingen (San Diego, Kalifornia, USA). O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie inne odczynniki zakupiono od Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). Izolacja leukocytów krwi obwodowej i limfocytów T oraz hodowla komórkowa. Izolację leukocytów krwi obwodowej i oczyszczanie komórek T wykonano zgodnie z opisem (18). Komórki hodowano w RPMI 1640 uzupełnionym 10% FCS, 100 U / ml penicyliny / streptomycyny, 2 mM L-glutaminy i 10 mM HEPES. Komórki T zależne od IL-2. przygotowano przez stymulowanie komórek T fitohemaglutyniną P (5 ug / ml) przez 72 godziny. Komórki następnie hodowano ze 100 U / ml IL-2. Raz w tygodniu komórki ponownie stymulowano fitohemaglutyniną P (0,8 .g / ml). W doświadczeniach z wykorzystaniem wortmaniny komórki hodowano w pożywce AIM-V (Life Technologies Inc., Gaithersburg, Maryland, USA). Immunoprecypitacja i Western blot. Komórki T zależne od IL-2 (1 x 107 do 2 x 107) przemyto dwukrotnie PBS (pH 6,5) i inkubowano przez 3 godziny w RPMI 1640 zawierającym 0,5% ludzkiej surowicy AB. Następnie inkubowano z peptydem (40 | jM), rapamycyną (100 nM) lub wortmaninem (100 nM) przez 30 minut przed stymulacją za pomocą 1000 U / ml IL-2 przez 15 minut. Po traktowaniu komórki ponownie zliczono, poddano lizie i poddano immunoprecypitacji i przepuszczeniu, jak opisano (15). Test kinazy Fyn i Lck. Komórki T zależne od IL-2 (5 x 106 na chorobę) aktywowano za pomocą IL-2, jak opisano powyżej. Komórki poddano lizie i testy kinazowe przeprowadzono zasadniczo zgodnie z opisem (19). Test na kinazę p70 S6. Komórki T zależne od IL-2 (107 na stan) aktywowano IL-2 w obecności różnych środków, jak opisano powyżej dla immunoprecypitacji. Próbki podzielono na dwie równe porcje, poddano lizie w buforze B (0,1% NP-40, 2 mM DTT, 50 mM P-glicerofosforanu, 10 mM KH2PO4, mM EDTA, 5 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 40 ug / mL PMSF i mM Na3VO4) i poddano immunoprecypitacji z użyciem kinazy S6 anty-p70. Jedną porcję poddano SDS-PAGE i analizie Western blot, jak opisano powyżej. Drugą porcję poddano obróbce pod kątem aktywności kinazy. Immunoprecypitowaną kinazę przemyto dwukrotnie buforem B, a następnie przemyto dwukrotnie w 10 mM P-glicerofosforanu, 10 mM MgCl2, 10 (ag / ml leupeptyny, 0,4 mM DTT i 20 mM Tris (pH 7,5). Bufor do kinazy (40 ul) zawierał 100 .M ATP, 200 .l / ml [a-32P] ATP (Amersham Life Sciences Inc., Arlington Heights, Illinois, USA) i peptyd 125 .M S6 (Santa Cruz Biotechnology Inc .). Mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 15 minut w 30 ° C, a następnie reakcję zakończono przez dodanie 40. L lodowatego 20 mM EDTA (pH 8,0). Trzykrotne porcje (10 ul) nakropiono na membrany fosfocelulozowe (Life Technologies Inc.). Membrany zanurzono krótko w 1% roztworze H3PO4 zawierającym 10 mM Na4P2O7, przemyto 1% H3PO4 i określono ilościowo za pomocą zliczania scyntylacyjnego w cieczy. Test kinazy Akt. Komórki T zależne od IL-2 (107 na stan) aktywowano za pomocą IL-2, jak opisano powyżej. Test kinazy Akt przeprowadzono stosując zestaw z Upstate Biotechnology Inc. Test kinazy 3 kinazy fosfatydyloinozytolowej
[przypisy: acetylowany adypinian diskrobiowy, ashwagandha skutki uboczne, baclofen alkoholizm ]