odtłuszczanie twarzy

Specyficzność immunobarwienia dla MK potwierdzono przez absorpcję przeciwciał anty-MK rekombinowanym MK, a następnie chromatografię powinowactwa na heparynie-Sepharoz, jak opisano poprzednio (25). Szczurzego mAb przeciwko antygenowi CD45 pospolicie leukocytarnym myszy (PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA) użyto do określenia obecności komórek zapalnych w skrawkach parafiny. Oprócz inkubacji z nieskoniugowanymi kozimi anty-szczurzymi IgG (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA) jako drugim przeciwciałem, inkubowano biotynylotyramid i streptawidynę-peroksydazę chrzanową (NEN Life Science Products, Boston, Massachusetts, USA). wykonywane w celu wzmocnienia sygnału. Kriosekcję barwiono monoklonalnym szczurzym anty-mysim znacznikiem monocytarno-makrofagowym MOMA-2 (Biosource International, Camarillo, Kalifornia, USA), monoklonalnym szczurzym anty-mysim markerem neutrofilowym 7/4 (Serotec Ltd., Oxford, Wielka Brytania), lub anty-CD45, po którym następuje detekcja fluorescencyjnym izotiocyjanianem-króliczym anty-szczurzym IgG (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, Kalifornia, USA). Hodowla makrofagów i oznaczanie migracji. Makrofagi zebrano z otrzewnej myszy, jak opisali Xie i in. (26). Migracja makrofagów została przetestowana przez modyfikację metody komory Boydena z użyciem komór Transwell (Costar, Cambridge, Massachusetts, USA) o porach o średnicy 5,0 .m, jak opisali Brown i in. (27). Podwielokrotności 1,0 x 106 komórek / ml w pożywce RPMI1640 zawierającej 5% FBS (100. L) umieszczono w górnej komorze. Następnie 600. L pożywki RPMI1640 zawierającej 5% FBS i MK umieszczono w dolnej komorze. Alternatywnie dolną powierzchnię filtra pokryto MK w PBS. Kultura komórek mięśni gładkich aorty i test migracji. Komórki mięśni gładkich aorty szczura przygotowano w sposób opisany przez Bassona i in. (28). Eksplantaty tkanki hodowano w DMEM uzupełnionym 10% FBS. Komórki mięśni gładkich w piątym do ósmego pasażu zastosowano do testu migracji wykonanego jak opisano dla migracji makrofagów. Kondycjonowaną pożywkę komórek mięśni gładkich zebrano po hodowli przez 2 dni i stosowano zamiast pożywki testowej. Test MTT (bromek 3- [4,5-dimetylotiazoilil-2-ilo] -2,5-difenylotetrazoliowy) przeprowadzono zgodnie z Fukuzawa i in. (29). Rezultaty Wyrażenie MK podczas tworzenia nowej błony wewnętrznej. Do określenia trybu ekspresji MK podczas tworzenia neointimy stosowano szczurzy model wykorzystujący wrodzone uszkodzenie balonu tętnicy szyjnej (18), ponieważ próbki szczurów są względnie duże i bardziej odpowiednie do analizy ilościowej niż myszy. Najpierw sklonowaliśmy cDNA szczurzego MK przez RT-PCR. Wydedukowana sekwencja aminokwasowa (numer dostępu EMBL / GenBank AB025023) wykazała 95% identyczność z mysią MK i 87% z ludzkim MK. Poziom RNA MK monitorowano za pomocą RT-PCR (Figura 1a), a ilościowo za pomocą kompetycyjnej PCR (Figura 1b). RNA MK było wyrażane na niskim poziomie w nieuszkodzonych tętnicach (ryc. 1, aib). Ta słaba ekspresja utrzymywała się przez 3 dni po uszkodzeniu balonika (w skrócie 3 dnia), chociaż po 3 godzinach zaobserwowano niewielki spadek ekspresji (Figura 1b). W dniu 14, kiedy tworzenie neointimy zostało zakończone, poziom RNA MK był nieznacznie zmniejszony w porównaniu z poziomem w dniu 7 (Figura 1b). Ekspresja MK osiągnęła maksimum w dniu 7, z indukcją ponad 10-krotnie w porównaniu z poziomem kontrolnym (Figura 1b). Analiza Western blotting potwierdziła, że ekspresja białka MK była podobna do ekspresji MK RNA (Figura 1c). Barwienie immunohistochemiczne ujawniło, że białko MK było obecne tylko w komórkach śródbłonka przed uszkodzeniem (Figura 2b), ale silnie ulegało ekspresji w regionie neointymalnym w dniu 7 (Figura 2d) i dniu 14 (Figura 2g)
[podobne: turkuć podjadek ciekawostki, urobilinogen w moczu norma, serwatka z mleka owczego ]