owoce oliwki

Lizaty komórkowe (20 .g białka) poddano SDS-PAGE przy użyciu 10% żelu (BioRad Laboratories, Hercules, California, USA) i przeniesiono na błonę PVDF (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA). Po zablokowaniu 5% odtłuszczonym mlekiem w soli fizjologicznej buforowanej Tris zawierającej 0,1% Tween-20 (TBST), błonę inkubowano przez godzinę z surowicami od pacjentów zakażonych MV, który rozpoznał białka MVNP i MVM (hojnie dostarczone przez Don Forthal , University of California w Irvine, Irvine, Kalifornia, USA) w rozcieńczeniu 1: 200 w TBST zawierającym 1% BSA. Następnie blot inkubowano przez godzinę z kozią przeciwciałem anty-króliczym IgG sprzężonym z peroksydazą chrzanową (DAKO Corp., Carpinteria, California, USA), a prążki ujawniono za pomocą ulepszonego układu chemiluminescencyjnego (Amersham Life Sciences Inc., Arlington Heights, Illinois, USA). Oznaczenie CFU-GM w hodowli metylocelulozowej. Transdukowane komórki hodowano przy 5 x 103 komórek / studzienkę w P-MEM (GIBCO BRL, Grand Island, Nowy Jork, USA) zawierającym 1,2% metylocelulozy, 30% FBS, 1% dejonizowanego BSA (Sigma Chemical Co., St. Missouri, USA) i 100 pg / ml rekombinowanego ludzkiego GM-CSF (Immunex Corp., Seattle, Washington, USA) z 500 .g / ml G418 lub bez. Transdukowane komórki wysiano w objętości 1,0 ml na 35-mm szalki hodowlanej (Corning, New York, New York, USA), jak podano wcześniej (11). Płytki inkubowano w 37 ° C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 przez 7 dni. Kolonie oceniano po 7 dniach hodowli przy użyciu odwróconego mikroskopu, a kolonie oporne na G418 zbierano indywidualnie, stosując drobno ciągnione pipety, do stosowania we wszystkich testach tworzenia OCL. Długotrwałe hodowle do tworzenia OCL. Komórki pochodzące od G418 oporne na CFU-GM (5 x 103), otrzymane jak opisano powyżej, hodowano w p-MEM zawierającym 20% surowicy końskiej, M-CSF (100 ng / ml) i albo 1,25 (OH ) 2D3 (10. 8 M) lub ligand RANK (100 ng / mL, obficie dostarczony przez Immunex Corp.), w szkiełkach laboratoryjnych Lab-Tek (Nalge Nunc International, Naperville, Illinois, USA). Hodowle były karmione co 3 dni przez zastąpienie połowy pożywki i po 14 dniach lub 21 dniach hodowli, komórki utrwalano 1% formaldehydem i badano pod kątem reaktywności krzyżowej z monoklonalnym przeciwciałem 23c6, które rozpoznaje receptor witronektynowy OCL (hojnie). dostarczone przez Michaela Hortona, Rayne Institute, Bone and Mineral Centre, Londyn, Zjednoczone Królestwo), przy użyciu zestawu VECTASTAIN-ABC-AP (Vector Laboratories). Komórki wielojądrowe 23c6-dodatnie oceniano za pomocą odwróconego mikroskopu. Testy resorpcji kości. Plastry zębiny wieloryba zostały wysterylizowane 70% etanolem. Transdukowane komórki (5 x 103) hoduje się do tworzenia komórek wielojądrowych, jak opisano powyżej. Gdy powstały komórki wielojądrowe, pożywkę zmieniono na a-MEM i 20% surowicę końską zawierającą 1,25- (OH) 2D3 (10. 8 M). Plastry zębinowe umieszczono w tych hodowlach i hodowlę kontynuowano przez tydzień. Aby usunąć komórki, plastry zębiny zostały wyszorowane szczoteczką do zębów. Plastry zębiny badano pod mikroskopem w celu wytworzenia luk resorpcyjnych. Amplifikacja PCR mRNA odwrotnej transkrypcji. Normalne komórki szpiku, hodowane przez 2 dni z supernatantami wirusowymi (lub po 7 dniach hodowli dla CFU-GM), poddano analizie RT-PCR pod kątem ekspresji IL-6, 24-hydroksylazy lub genu RANK w następujący sposób. Całkowity RNA z tych komórek ekstrahowano przy użyciu roztworu RNAzol B (Tel-Test Inc., Friendswood, Texas, USA) i poddano odwrotnej transkrypcji. Pięć procent puli pierwszej nici cDNA poddano amplifikacji PCR przy użyciu starterów PCR specyficznych dla genu zgodnie ze standardowymi protokołami. Startery specyficzne dla genu dla mRNA IL-6 (nr dostępu w GenBank S56892) były 5a-ATG AAC TCC TTC ACA AGC GC-3. (sens) i 5a -GAA GAG CCC TCA GGC TGG ACT G-3. (antysensowny)
[przypisy: baclofen alkoholizm, badanie żywej kropli krwi wrocław, aktualne występowanie grzybów ]