Startery specyficzne dla genu dla mRNA 24-hydroksylazy (nr dostępu w GenBank L13286) stanowiły 5 (3-ATT ACC TGA GAA TCA GAG GCC ACG-3. (sens) i 5 (3-GCC AAA TGC AGT TTA AGC TCT GCT-3. (antysensowny). Startery specyficzne dla genu dla mRNA RANK (numer dostępu w GenBank AF018253) to 5a-GTC TGC CCT GTG GCC CGG ATG AA-3. (sens) i 5. -GCA AAC GCC AAA GAT GAT GGC AG-3. (antysensowny). Warunki amplifikacji były następujące: 5-minutowy etap inicjacji w 94 ° C; 35 cykli w 94 ° C przez minutę, 55 ° C przez minutę i 72 ° C przez minutę; i na koniec etap wydłużania w 72 ° C przez 7 minut. Wstępne eksperymenty wykazały, że te stany występowały podczas liniowej fazy reakcji PCR. Produkty PCR rozdzielono za pomocą 2% elektroforezy w żelu agarozowym i ujawniono je przy barwieniu bromkiem etydyny w świetle ultrafioletowym. Względne ilości eksprymowanego mRNA RANK określono przez densytometrię i porównano z poziomami ekspresji mRNA p-aktyny. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej. Ekstrakty jądrowe otrzymano z komórek pochodzących z CFU-GM (106), jak opisali Dignam i współpracownicy (15). Sekwencja oligonukleotydu wiążącego NF-pBs stosowanego jako sonda radioaktywnego DNA to 5a-AAG TGA GGG GAC TTT CCC AGG-3 .. Reakcję wiązania DNA przeprowadzono w temperaturze pokojowej w objętości 15 ul, która zawierała bufor wiążący (10 mM Tris-HCl przy pH 7,5, 0,5 mM EDTA, mM MgCl2, 4% glicerolu, 50 mM NaCl i 0,5 mM DTT), 50 (ig / ml poli (dl-dC), sonda znakowana 32P / s białka 105 cpm i 8 (ig białek jądrowych w obecności lub nieobecności 50-krotnej nadmiaru niewyznakowanej sondy. Po inkubacji przez 20 minut próbki poddawano elektroforezie na natywnych 6% akrylamidowych żelach 10 mM Tris-glicyna (pH 8,6). Żele wysuszono i wystawiono na promieniowanie rentgenowskie przez noc. Statystyka. Wydajność transdukcji określono przez obliczenie stosunku liczby kolonii CFU-GM, które powstały w obecności G418 do liczby, która powstała w nieobecności G418. Wyniki transdukcji i oznaczeń hodowli podano jako średnie. SD. Istotność oceniano stosując dwustronny, niesparowany test Studenta, przy czym P <0,05 uznano za znaczący. Eksperymenty z użyciem komórek szpiku kostnego od 10 z 10 osobnych dawców zdrowych szpiku wykazały podobny wzór wyników. Wyniki Transdukcja prekursorów OCL. Dwa dni po transdukcji genu MVNP do ludzkich komórek szpiku kostnego, ekspresję genu MVNP oceniano przez immunobarwienie; 10-15% komórek reagowało krzyżowo z przeciwciałem monoklonalnym anty-MVNP (Figura 1a). Komórki następnie hodowano do CFU-GM, najwcześniejszego identyfikowalnego prekursora OCL, z lub bez G418 (500 .g / ml). Wydajność transdukcji oceniona w 7 dniu tworzenia kolonii CFU-GM wynosiła w przybliżeniu 20% (Figura 1b). Prawie wszystkie nietransdukowane komórki zostały zabite przez traktowanie hodowli 500 .g / ml G418 (Figura 1b). Analiza Western blot potwierdziła, że transdukowane komórki wyrażały odpowiednie białko MV (Figura 1c). Figura 1: Transdukcja prekursorów OCL. (a) Immunologiczne barwienie ludzkich komórek szpiku kostnego w celu ekspresji MV. Dwa dni po transdukcji genów MVNP i MVM do ludzkich komórek szpiku kostnego, ekspresję genu oceniano przez immunobarwienie z użyciem przeciwciał monoklonalnych anty-MVNP i anty-MVM. Ciemne zabarwienie oznacza pozytywną reaktywność. Podobny wzór immunobarwienia wykryto w 3 oddzielnych eksperymentach. (b) tworzenie kolonii CFU-GM z transdukowanych normalnych ludzkich komórek szpiku kostnego. Komórki hodowano dla CFU-GM, najwcześniejszego identyfikowalnego prekursora OCL, z lub bez G418 (500 .g / ml). Wydajność transdukcji oceniano przez zliczenie rozwiniętego CFU-GM w dniu 7. Wyniki reprezentują wyniki z typowego eksperymentu. * P <0,05 w porównaniu z nietransdukowanymi komórkami; ** P <0,01 w porównaniu z nietransdukowanymi komórkami hodowanymi z 500 .g / ml G418 [więcej w: serwatka z mleka owczego, ból pod lewą łopatką przyczyny, żółty stolec ]