podwyższony poziom erytrocytów w krwi

Dane są reprezentatywne dla 4 eksperymentów. Ponieważ Ser345 znajduje się w sekwencji rozpoznawanej i ufosforylowanej przez MAPK (-PXSP-), zbadaliśmy, która MAPK była zaangażowana w GM-CSF. i TNF-a indukowała fosforylację p47phox w Ser345 przez testowanie działania różnych inhibitorów MAPK. Jako GM-CSF i TNF-a indukują aktywację odpowiednio ERK1 / 2 i p38 MAPK w zawieszonych ludzkich neutrofilach (figura 5A i odn. 39, 40), użyliśmy PD98059 i UO126, które hamują MEK1 / 2 (górny aktywator ERK1 / 2) (48 49), a także SB203580, inhibitor p38 MAPK (50), w celu analizy roli tych 2 szlaków MAPK w fosforylacji p47phox w nienaruszonych neutrofilach. Neutrofile inkubowano przez 45 minut z PD98059 (50. M), UO126 (10. M) lub SB203580 (10. M), następnie traktowano GM-CSF lub TNF-a. Status fosforylacji p47phox analizowano przez porównanie wyników 2 metod (znakowanie 32P i przeciwciało anty-fosfo-Ser345). Jak pokazano na Figurze 5B, PD98059 i UO126 zniosły fosforylację p47phox na Ser345 równolegle z hamowaniem fosforylacji ERK1 / 2 (Figura 5B, p-ERK1 / 2) indukowaną przez GM-CSF. SB203580 nie miał działania hamującego; raczej umiarkowanie zwiększona indukowana przez GM-CSFa fosforylacja p47phox i ERK1 / 2, efekt nie jest tu dalej badany. To silnie wskazywało na ERK1 / 2 jako kinazę zaangażowaną w fosforylację p47phox na Ser345 w ludzkich neutrofilach stymulowanych GM-CSFa. Jednakże w odniesieniu do neutrofili traktowanych TNF-a, inhibitor p38 MAPK SB203580 hamował fosforylację p47phox na Ser345, ale inhibitory MEK1 / 2 (PD98059 i U0126) nie wywierały skutków (Figura 5C). W tych warunkach SB203580 inhibitował aktywność p38 MAPK, jak pokazano przez hamowanie fosforylacji hsp27, znanego substratu aktywowanej MAPK kinazy 2, która jest dalszym celem p38 MAPK. We wszystkich tych eksperymentach, specyficzne wykrywanie p47phox, ERK1 / 2 i hsp27 ze swoistymi przeciwciałami, które rozpoznają niefosforylowane, jak również fosforylowane białka, wykazało, że te same ilości każdego białka były obecne w każdej próbce (Figura 5, AOC, i dane nie pokazane). Wszystkie te wyniki sugerują, że ERK1 / 2 są kinazami zaangażowanymi w fosforylację p47phox na Ser345 w ludzkich neutrofilach stymulowanych GM-CSFa, podczas gdy p38 MAPK jest kinazą zaangażowaną w fosforylację p47phox na Ser345 w ludzkich neutrofilach stymulowanych TNF-a. Te 2 ścieżki mogą być zbieżne w odniesieniu do fosforylacji p47phox w tym konkretnym miejscu. Figura 5 Wpływ inhibitorów MAPK na GM-CSF. i TNF-a indukowało aktywację p47phox i MAPK. (A) Neutrofile (1 x 107 komórek / ml) inkubowano z GM-CSF (12,5 ng / ml) lub TNF-a. (10 ng / ml) przez 20 minut i zlizowano, a białka z 4 x 105 komórek analizowano za pomocą SDS-PAGE i immunoblotting z przeciwciałem anty-fosfo-ERK1 / 2 lub anty-fosfo-p38 (p-p38MAPK). (B i C) Neutrofile inkubowano z SB203580 (10. M), PD98059 (50. M) lub UO126 (10. M) przez 30 minut, a następnie traktowano GM-CSF (B) lub TNF-a. (C) przez 20 minut. p47phox z neutrofili wyznakowanych 32P (komórki 5 x 107) poddano immunoprecypitacji z przeciwciałem anty-p47phox i analizowano metodą SDS-PAGE, Western blotting i autoradiografii. Całkowite lizaty komórek (4 x 105 komórek) z nieznakowanych komórek analizowano również za pomocą SDS-PAGE i Western blot z przeciwciałem anty-fosfo-Ser345 lub przeciwciałem anty-fosfo-ERK1 / 2 (p-ERK1 / 2), które odzwierciedlają MEK1 / 2 działania. Aktywność p38 MAPK oceniano metodą fosforylacji in vitro hsp27, jak opisano w Metodach. Dane są reprezentatywne dla 3 eksperymentów. Mutacja Ser345 do Ala hamuje proces primingu w komórkach HL-60. Aby sprawdzić, czy fosforylacja Ser345 p47phox jest wymagana do primingu oksydazy NADPH w nienaruszonych komórkach, użyliśmy plazmidu, który koduje p47phox, w którym Ser345 został zmutowany do alaniny (S345A), w porównaniu z plazmidem, który koduje WT p47phox
[patrz też: złamanie collesa, artefakty ruchowe, acetylowany adypinian diskrobiowy ]