radomskie centrum krwiodawstwa

Wykonano skanowanie Western blot z różnych eksperymentów; fosforylowane i całkowite p47phox zostały określone ilościowo za pomocą densytometrii; a intensywność fosforylowanego p47phox skorygowano na ilość p47phox. Wyniki wyrażono jako średnie. SEM (n = 3). * P <0,05 w porównaniu z nietraktowanymi neutrofilami lub czas 0 minut. Następnie zbadaliśmy, czy inne czynniki aktywujące neutrofile, takie jak peptyd chemoatraktantowy fMLP i aktywator kinazy białkowej C PMA, mogą indukować fosforylację Ser345. Przebieg w czasie i badania odpowiedzi na dawkę (Figura 3, A i B) wykazały, że fMLP i PMA słabo indukowały fosforylację Ser345 w porównaniu z fosforylacją indukowaną przez prozapalne cytokiny GM-CSF i TNF-a. Specyficzne wykrywanie p47phox za pomocą przeciwciała, które rozpoznaje niefosforylowane, jak również fosforylowane białko, wykazało, że ta sama ilość p47phox była obecna w każdej próbce. Te wyniki sugerują, że Ser345 jest silniej fosforylowany podczas GM-CSF. lub indukowane przez TNF-y priming, niż w warunkach stymulacji. Figura 3 Wpływ różnych agonistów neutrofili na fosforylację Ser345. Neutrofile (1 x 107 komórek / ml) inkubowano z GM-CSF (12,5 ng / ml) przez 20 minut, TNF-a. (10 ng / ml) przez 20 minut i różne stężenia fMLP (A) lub PMA (B) dla różnych okresów czasu. Komórki następnie poddano lizie i białka z 4 x 105 komórek analizowano za pomocą SDS-PAGE i immunoblotting z przeciwciałem anty-fosfo-Ser345 lub przeciwciałem anty-p47phox. Dane są reprezentatywne dla 3 niezależnych doświadczeń z użyciem komórek od różnych dawców. Wpływ kinazy tyrozynowej i inhibitorów MAPK na GM-CSF. i fosforylację p47phox indukowaną przez TNF-a. Mieloidalne komórki, takie jak neutrofile, są terminalnie zróżnicowanymi, krótko żyjącymi komórkami i są oporne na transfekcję. Alternatywną strategią badania roli określonych enzymów jest stosowanie inhibitorów farmakologicznych, które są przenikalne dla komórek. W poprzednich badaniach (29, 30) wykazaliśmy, za pomocą znakowania 32P, że białkowy inhibitor kinazy tyrozynowej o szerokim zakresie genisteina hamuje GM-CSF. i fosforylację p47phox indukowaną przez TNF-a. Aby sprawdzić, czy fosforylacja Ser345 wykryta przy użyciu określonego przeciwciała jest kontrolowana przez te same wcześniejsze kinazy tyrozynowe, przetestowaliśmy wpływ genisteiny na ten proces. Najpierw, p47phox z neutrofili wyznakowanych 32P (komórki 5 x 107) poddano immunoprecypitacji z użyciem anty-p47phox i analizowano przez SDS-PAGE, Western blotting i autoradiografię (Figura 4, A i B; [32P] p47phox). Po drugie, całkowite lizaty komórek (4 x 105 komórek) analizowano za pomocą SDS-PAGE i Western blot z przeciwciałem anty-fosfo-Ser345 (Figura 4, A i B, p-Ser345). Obie metody wykazały, że genisteina hamuje GM-CSF. i fosforylację p47phox indukowaną TNF-,, potwierdzając, że przeciwciało anty-fosfo-Ser345 rozpoznaje miejsce ufosforylowane na p47phox indukowane przez GM-CSF i TNF-a. i że wrażliwa na genisteinę kinaza tyrozynowa kontroluje to zdarzenie. Figura 4 Wpływ genisteiny, inhibitora białkowej kinazy tyrozynowej, na GM-CSF. i fosforylację p47phox indukowaną przez TNF-a. Neutrofile inkubowano bez (kontrola) lub ze 100. M genisteiną przez 30 minut, a następnie z 12,5 ng / ml GM-CSF (A) lub 10 ng / ml TNF-a. przez 20 minut (B). p47phox z neutrofili wyznakowanych 32P (komórki 5 x 107) poddano immunoprecypitacji z przeciwciałem anty-p47phox i analizowano za pomocą SDS-PAGE, Western blotting i autoradiografii ([32P] p47phox). Całkowite lizaty komórkowe (4 x 105 komórek) z nieznakowanych traktowanych komórek analizowano również za pomocą SDS-PAGE i Western blot stosując przeciwciało anty-fosfo-Ser345 lub przeciwciało anty-p47phox
[patrz też: artefakty ruchowe, ashwagandha skutki uboczne, występowanie grzybów ]