Upośledzona ekspresja receptora trombopoetyny przez płytki krwi od pacjentów z czerwienicą prawdziwą ad

Ponieważ płytki krwi eksprymują Mpl24 i ponieważ komórki krwi w czerwienicy prawdziwej pochodzą od nieprawidłowego klonu, badaliśmy indukowaną przez trombopoietinę transdukcję sygnału w płytkach krwi. Zaobserwowaliśmy, że fosforylacja białek indukowana przez trombopoetynę in vitro była upośledzona w płytkach od pacjentów z czerwienicą prawdziwą w porównaniu z normalnymi płytkami krwi i że ten defekt sygnalizacyjny był związany ze zmniejszoną ekspresją receptora trombopoetyny w płytkach krwi i megakariocytach. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych nieprawidłowości płytek krwi u pacjentów z czerwienicą prawdziwą, które mogą różnić się od pacjenta do pacjenta, 25-27 Niedobór Mpl obserwowano w płytkach krwi od wszystkich 34 pacjentów z czerwienicą prawdziwą, którą badaliśmy. Co więcej, ta nieprawidłowość odróżniła płytki krwi od pacjentów z czerwienicą prawdziwą od pacjentów z łagodną (wtórną) erytrocytozą. Metody
Przedmioty
Tabela 1. Tabela 1. Charakterystyka kliniczna i laboratoryjna uczestników badania. Przebadaliśmy 64 pacjentów z przewlekłymi zaburzeniami mieloproliferacyjnymi: 34 z czerwienicą prawdziwą, 14 z idiopatyczną mielofibrozą, 9 z istotną trombocytozą i 7 z przewlekłą białaczką szpikową. Protokół badania został zatwierdzony przez nasz wspólny komitet ds. Badań klinicznych i od każdej pacjentki uzyskano świadomą zgodę. Rozpoznanie czerwienicy prawdziwej oparto na kryteriach Grupy Badawczej Velika 3, która obejmowała podwyższoną masę krwinek czerwonych. Rozpoznanie innych przewlekłych zaburzeń mieloproliferacyjnych było oparte na standardowych kryteriach klinicznych. 29 Badaniami objęto 14 pacjentów z erytrocytozą (z powodu 2 pacjentów z przeszczepieniem nerki, z wrodzoną wadą serca u pacjenta, z odmianą hemoglobiny u pacjenta). nieznane przyczyny u 10 pacjentów), 8 pacjentów z hemochromatozą, poddawanych okresowym upuszczeniom terapeutycznym, 2 pacjentom z niepowikłanym niedoborem żelaza i 10 pacjentom zdrowym (Tabela 1).
Fosforylacja tyrozyny białek płytek krwi
Krew żylną zebraną w 3,8% cytrynianie sodu odwirowano przy 160 xg przez 10 minut w celu uzyskania osocza bogatopłytkowego. Osocze bogate w płytki wirowano przy 750 x g przez 12 minut, a osad płytkowy przemyto trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanem zawierającą 0,5 procent albuminy surowicy bydlęcej i 0,6 procent cytrynianu sodu (bufor do przemywania). Płytki ponownie zawieszono w buforze do płukania i wyliczono w elektronicznym liczniku cząstek, a objętość buforu dostosowano, aby uzyskać stężenie płytek wynoszące 10 9 komórek na mililitr. Płytki krwi eksponowano na trombinę lub trombopoetynę w wybranych stężeniach przez wskazany czas w temperaturze pokojowej, a następnie poddawano lizie w 20 mM buforze TRIS (pH 7,5) zawierającym procent Nonidet P40, 137 mM chlorku sodu, 10 procent glicerolu, mM EDTA, 50 mM fluorku sodu, 5 mM chlorku magnezu, 2 mM wanadanu sodu, mM fluorku fenylometylosulfonylu, 2 .g aprotyniny na mililitr, 2 .g leupeptyny na mililitr i .g pepstatyny na mililitr (bufor do lizy). Stężenie białka w lizatach płytek oceniono ilościowo techniką kwasu bicinchoninowego.30
Immunoblot i immunoprecypitacja lizatów płytek krwi
Równe alikwoty białka lizatu płytek poddano elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (7,5%) (SDS-PAGE), a następnie przeniesiono na membranę nitrocelulozową przy 20 V przez 16 godzin.
[podobne: busulfan, suprasorb, Enterolcitalopram ]
[podobne: artefakty ruchowe, ashwagandha skutki uboczne, babka płesznik dawkowanie ]