Upośledzona ekspresja receptora trombopoetyny przez płytki krwi od pacjentów z czerwienicą prawdziwą cd

Membranę blokowano roztworem 10 mmoli TRIS na litr, 150 mmol chlorku sodu na litr (pH 7,6) i 1% Tween 20 (TBST) i 5 procent albuminy surowicy bydlęcej w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, przemyto trzy razy. z TBST, a następnie inkubowano w TBST z .g pierwotnego przeciwciała na mililitr na jedną godzinę. Membranę płukano trzy razy, inkubowano przez godzinę z odpowiednim wtórnym przeciwciałem powiązanym z peroksydazą chrzanową rozcieńczonym 1: 10 000 w TBST, a następnie przemywano trzy razy. Detekcję za pomocą ulepszonej chemiluminescencji przeprowadzono zgodnie ze specyfikacjami producenta (Amersham, Arlington Heights, IL). Membrany poddano ponownemu działaniu różnych przeciwciał po odpędzeniu w 62,5 mmolach TRIS na litr (pH 6,7) z 2% SDS i 100 mmolami merkaptoetanolu na litr w temperaturze 70 ° C przez 30 minut. Do immunoprecypitacji dodano przeciwciało do lizatu płytek (200 .g lizatu rozcieńczonego do .g na mikrolitr w buforze do lizy) w stężeniu .g na 0,1 ml i inkubowano w temperaturze 4 ° C przez dwie godziny. Do lizatu dodano białko A Sepharose (Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja), 0,1 ml 50% zawiesiny w buforze do lizy i inkubowano przez dodatkową godzinę w 4 ° C z kołysaniem. Próbkę następnie przemyto czterokrotnie 10 mM buforem TRIS (pH 7,4) zawierającym 1% Triton X-100, 150 mM chlorek sodu, mM Bis- (.-aminoetyloeteru) glikolu etylenowego) -N, N, N , N kwas tetraoctowy, 2 mM wanadan sodu i mM fluorek fenylometylosulfonylu; ponownie zawieszono w buforze do próbek SDS-PAGE; gotowane przez pięć minut; poddany SDS-PAGE; i przeniesiono na membranę nitrocelulozową do immunoblottingu, jak opisano powyżej. Analiza densytometryczna
Autoradiogramy immunoblotów skanowano za pomocą urządzenia Hewlett-Packard ScanJet IIc (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) i przeprowadzono densytometrię za pomocą oprogramowania NIH Image (wersja 2.3). Absorbancję pasma 85 kD (Mpl) określono ilościowo jako pole pod pikiem pasma i wyrażono w arbitralnych jednostkach absorbancji. W pilotażowych eksperymentach zidentyfikowano ilość białka lizatu płytek krwi (35 .g), które wytworzyło odpowiedź liniową. Obciążenie białka kontrolowano przez powtórne badanie błony z surowicy odpornościowej glikoproteiny IIIa w celu potwierdzenia, że podobne ilości lizatu płytek krwi były obecne w każdej próbce. Ekspresję Mpl określono przez podzielenie wartości dla pacjentów przez średnie wartości dla osobników kontrolnych na tej samej immunoblotce. Różnice w odpowiedziach u osób kontrolnych na danej immunoblotce nigdy nie przekroczyły 15 procent.
Immunohistochemiczna analiza biopsji szpiku kostnego
Sekwencyjne wycinki biopsji szpiku od pacjentów z czerwienicą prawdziwą lub osobnikami kontrolnymi eksponowano na oczyszczoną przez powinowactwo surowicę odpornościową królika Mpl w rozcieńczeniu 1: 300 lub inkubowano najpierw z proteazą XXVII (Sigma) przez 20 minut, a następnie z kozim antyludzkim von Przeciwciało Willebrand (Dako, Carpinteria, CA) w rozcieńczeniu 1: 100, a następnie ekspozycja na odpowiednie drugorzędowe przeciwciało i substrat znakowane peroksydazą.
Test osoczowy na trombopoetynę
Trombopoetynę mierzono w próbkach osocza traktowanych EDTA od pacjentów i kontroli za pomocą testu immunologicznego związanego z enzymem (Amgen, Thousand Oaks, CA). 31 Średnia wartość u zdrowych osobników wynosiła 133 pg na mililitr (zakres, od 55 do 377).
[hasła pokrewne: Enterolcitalopram, amiodaron, busulfan ]
[hasła pokrewne: baclofen alkoholizm, badanie trus, badanie żywej kropli krwi wrocław ]