zwyrodnienie plamki żółtej leczenie warszawa

Klony cDNA MVNP i MVM były hojnymi prezentami od Chris Richardson, University of Toronto, Toronto, Kanada. Fragment cDNA MVNP o długości 1,6 kb wycięto z plazmidu pETL-NP # 30 przez trawienie NheI i subklonowano do wektora retrowirusowego pLXSN (CLONTECH Laboratories Inc., Palo Alto, California, USA) w miejscu XhoI. Powstały klon plazmidu pILXAN # transkrybuje ekspresję mRNA MVNP pod kontrolą 5. Elementy promotora wirusa LTR. Podobnie, konstrukt retrowirusowy MVM pILXB29M # 2 opracowano przez subklonowanie fragmentu DNA o długości kb kodującego gen MVM do wektora pLXSN. Zrekombinowane konstrukty plazmidowe transfekowano do amfoterycznej linii komórek pakujących PT67 przy użyciu metody z fosforanem wapnia (12). Stabilne klonalne linie komórkowe PT67-NP # 2 i PT67-M # 2, wytwarzające rekombinowany retrowirus MVNP i MVM przy wysokim mianie (106 cząstek wirusa / ml), ustalono przez wybór oporności na neomycynę (600 .g / ml). Podobnie ustalono linię komórkową wytwarzającą retrowirusy PT67-EV przez transfekcję komórek pustym wektorem pLXSN (EV). Produkcyjne linie komórkowe utrzymywano w DMEM zawierającym 10% FBS, 100 U / ml streptomycyny i penicyliny, 4 mM L-glutaminy i wysokiej glukozy (4,5 g / l). Supernatanty retrowirusowe z hodowlanych komórek producenta zebrano i przefiltrowano (średnica porów 0,45 .m) do natychmiastowego użycia. Przygotowane zapasy retrowirusów okazały się wolne od pomocy w oznaczeniu markerowym (13). Wirusowe miana obecne w supernatantach hodowli oznaczano przez wielokrotność infekcji komórek fibroblastów NIH 3T3 w seryjnych rozcieńczeniach, i otrzymano oporną na G418 (0,5 mg / ml G418) CFU utworzoną jak opisano (14). Transdukcja ludzkich komórek szpiku kostnego. Wyizolowane ludzkie komórki szpiku kostnego wstępnie stymulowano przez dzień w P-MEM zawierającym 10 ng / ml każdego z IL-3, IL-6 i czynnik komórek macierzystych (R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA) i 10% FBS. (GIBCO BRL, Grand Island, Nowy Jork, USA). Po wstępnej stymulacji komórki szpiku kostnego hodowano przez 96 godzin w 37 ° C w wilgotnej atmosferze 5% CO2, przy gęstości 105 komórek / ml do 2 x 105 komórek / ml, z supernatantem zawierającym wektor. Hodowle uzupełniono 4 .g / ml polibrenu, 20 ng / ml IL-3, 50 ng / ml IL-6 i 100 ng / ml czynnika komórek macierzystych. We wstępnych eksperymentach ustaliliśmy kombinację cytokin, która wspiera najwyższą wydajność transdukcji. Po 24 godzinach komórki odwirowano i usunięto stary supernatant. Dodano świeżo przygotowane supernatanty wirusowe suplementowane polibrenem i czynniki wzrostu i hodowle kontynuowano przez 24 godziny. W dniu 3 zebrano komórki do krótkotrwałych testów klonogennych CFU-GM w metylocelulozie (jak opisano poniżej). Próbkę komórek oceniano pod względem ekspresji MVNP przez immunobarwienie i analizę Western blot. Jako kontrolę, niektóre komórki hodowano w tych samych warunkach eksperymentalnych, z wyjątkiem tego, że dodawano wirusowy supernatant zawierający EV lub w ogóle nie dodano supernatantu wirusa. Immunobarwione. Przeciwciała monoklonalne reagujące z MVNP i MVM uzyskano z Chemicon International (Temecula, Kalifornia, USA). Komórki utrwalono 1% formaldehydem, a reaktywność krzyżową z różnymi przeciwciałami monoklonalnymi określono przy użyciu skoniugowanej awidyny-biotyny. Króliczej anty-mysiej IgG sprzężonej z alkaliczną fosfatazą (zestaw VECTASTAIN-ABC-AP, Vector Laboratories, Burlingame, California, USA). Analiza Western blot. Normalne ludzkie jednojądrzaste komórki szpiku kostnego poddano transdukcji retrowirusami PT67-NP # 2 i PT67-M # 2 eksprymującymi odpowiednio białka MVNP i MVM, jak opisano powyżej. Po 48 godzinach komórki przemyto dwukrotnie lodowato zimnym PBS i poddano lizie buforem do próbek SDS (62,5 mM Tris-HCl przy pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerolu, 50 mM DTT i 0,1% błękitu bromofenolowego)
[patrz też: wodniak powrózka nasiennego, babka płesznik dawkowanie, kątnica jelita grubego ]